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Jun 26, 2023

Pixels

Scientific Reports volume 13, Numéro d'article : 2934 (2023) Citer cet article 943 Accès aux détails de 3 Altmetric Metrics L'interaction réelle entre les espèces de signalisation dans les processus cellulaires est souvent

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 2934 (2023) Citer cet article

943 Accès

3 Altmétrique

Détails des métriques

L’interaction réelle entre les espèces de signalisation dans les processus cellulaires est souvent plus importante que leurs niveaux d’expression. Le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) est un outil populaire pour étudier les interactions moléculaires, car il est très sensible à la proximité dans la plage de 2 à 10 nm. Le FRET quantitatif (3 cubes) corrigé des débordements spectraux est une approche rentable et polyvalente, qui peut être appliquée en cytométrie en flux et dans diverses modalités de microscopie à fluorescence, mais peut être gênée par différents niveaux d'autofluorescence. Ici, nous avons mis en œuvre une correction d’autofluorescence pixel par pixel dans les mesures microscopiques FRET, en exploitant des standards d’étalonnage sans cellules dépourvus d’autofluorescence qui permettent la détermination correcte de tous les facteurs de débordement spectraux. Nous présentons également un plugin ImageJ/Fiji pour l'analyse interactive d'images uniques ainsi que la création automatique de cartes quantitatives d'efficacité FRET à partir de grands ensembles d'images. Pour la validation, nous avons utilisé des modèles FRET basés sur des billes et des cellules couvrant une gamme de rapports signal/autofluorescence et d'efficacités FRET et avons comparé l'approche avec la correction moyenne conventionnelle d'autofluorescence/de fond. La correction de l'autofluorescence pixel par pixel s'est avérée supérieure en termes de précision des résultats, en particulier pour les échantillons présentant une autofluorescence spatialement variable et de faibles rapports fluorescence/autofluorescence, ce dernier étant souvent le cas pour les niveaux d'expression physiologiques.

Le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) est un transfert d'énergie non collisionnel et non radiatif entre un colorant donneur fluorescent et un colorant accepteur spectralement adéquat, qui, pour des raisons pratiques, est souvent choisi comme étant fluorescent1. À partir de la fin des années 1960, le FRET est progressivement devenu un outil populaire pour déterminer la proximité entre macromolécules. L'efficacité du transfert d'énergie (E) est fonction de la puissance inverse du sixième de la distance entre les colorants donneur et accepteur, qui change rapidement dans la plage de 2 à 10 nm. Cette plage de sensibilité sert de base pour établir et comparer des interactions au niveau moléculaire, même dans des instruments optiques qui sont par ailleurs limités à un pouvoir de résolution moindre dû à la diffraction2. Même avec l'amélioration rapide des techniques de superrésolution qui repoussent la limite de résolution de plus en plus bas, il reste beaucoup de place pour les techniques de FRET3. Il existe une grande variété d'approches pour mesurer le FRET en microscopie4, depuis les mesures de molécules uniques5,6 jusqu'aux approches d'ensemble, dont beaucoup ne nécessitent pas d'instrumentation coûteuse et/ou ne sont pas destructives pour l'échantillon7,8,9. Celles-ci englobent des méthodes ratiométriques qui sont mieux utilisées dans le domaine en constante expansion des biocapteurs à base de protéines fluorescentes avec une stœchiométrie donneur/accepteur connue10 ainsi que des modalités de mesure quantitatives qui donnent une efficacité FRET calibrée indépendante de la stœchiométrie donneur/accepteur11. Parmi celles-ci, l’imagerie à vie par fluorescence (FLIM) représente une méthode intrinsèquement quantitative mais nécessite une instrumentation avancée12,13, tandis que le FRET à débordement spectral corrigé (ou à trois cubes) est une approche rentable et polyvalente, qui peut être appliquée en cytométrie en flux et en cytométrie conventionnelle. microscopie à fluorescence. Contrairement à la technique de photoblanchiment par accepteur également populaire14,15, elle peut également être utilisée en conjonction avec l’analyse accélérée et l’analyse d’images 3D11,16.

La principale limitation de chaque méthode de mesure de FRET est le rapport signal sur bruit (SNR). SNR est la valeur attendue du signal divisée par son SD. Ici, le bruit de toutes les intensités de fluorescence mesurées utilisées dans d’autres calculs se propage dans l’efficacité du FRET. En supposant une distribution poissonienne des photons détectés par pixel avec une valeur attendue λ, si le bruit systématique est négligeable, le SNR est √λ, donc des intensités plus faibles devraient augmenter davantage l'incertitude du FRET E déterminé. Les échantillons avec un faible SNR peuvent être rendus plus sensibles à l'analyse FRET en améliorant l'efficacité quantique et la photostabilité des colorants fluorescents, en utilisant une détection plus efficace17, en optimisant les paires de colorants FRET18,19 et par des approches mathématiques et statistiques améliorées20,21,22. 23. L’utilisation de la méthode spectrale corrigée par débordement permet généralement de conclure sur les interactions moléculaires existantes lorsqu’une efficacité FRET d’environ 5 % ou plus est observée.